큰입 농어를 위한 바이오필터 미디어 선택- 생물막 특성 및 성장 성능
큰입배스(Micropterus salmoides)캘리포니아 배스라고도 알려진 은 Actinopterygii, Perciformes, Centrarchidae, Micropterus에 속합니다. 미국 캘리포니아주가 원산지로 성장이 빠르고 맛이 좋으며 영양이 풍부하고 경제적 가치가 높은 등의 장점을 가지고 있습니다. 중국의 중요한 담수 양식종 중 하나가 되었습니다. 최근 몇 년 동안 어업의 변화와 업그레이드, 디지털 및 지능형 어업의 활발한 발전을 배경으로 산업화된 순환 양식업이 점차 등장했습니다. 큰입배스의 양식 방식도 전통적인 연못 양식에서 친환경적이고 효율적인 재순환 양식 방식으로 전환되고 있습니다. 순환 양식은 물과 토지 절약, 높은 수용 밀도, 편리한 관리 등의 장점을 가지고 있습니다. 물리적, 생물학적, 화학적 방법 및 장비를 통해 수역의 고형 부유 물질과 유해 물질을 제거하거나 무해한 물질로 전환하여 수질이 양식 종의 정상적인 성장 요구를 충족시키고 고밀도 양식 조건에서 물 재활용을 실현합니다.- 다양한 양식종에서 좋은 경제적 이익을 얻었습니다.
현재 큰입배스 순환양식에 관한 연구는 주로 번식, 사료영양, 계통선별, 정밀사료, 수질환경변화, 영양품질 등에 중점을 두고 있다. 큰입농어의 실내 산업화 순환 양식에 관한 연구는 주로 대형-치어 양식에 중점을 두고 있으며, 전체-주기 성어 양식은 널리 홍보되지 않았습니다. 큰입배스 순환 양식이 직면한 주요 과제는 양식 종의 정상적인 성장을 보장하기 위해 고밀도 조건에서 좋은 수질 환경을 유지하는 것입니다. 수처리는 순환양식의 핵심이며, 효율적인 수처리 바이오여과재는 수처리 시스템의 기초입니다. 바이오여과재에 의한 수질 정화에 관한 많은 보고가 있지만 특히 효과적인 수처리 바이오여재의 선별, 다양한 바이오여과재에 대한 생물막의 미생물 군집 구조, 처리 효과 및 양식 종의 성장에 미치는 영향에 관한 큰입 배스 산업화 재순환 양식에 대한 보고서는 부족합니다. 세 가지 유형의 바이오 필터 미디어가 선택되었으며 그 중 사각형 스폰지와 유동층 볼 바이오 필터 미디어는 저렴하고- 작동이 간단하며 양식업 꼬리 물 처리에 널리 사용되었습니다. Mutag Biochip 30(약칭: Biochip)은 최근 몇 년간 등장한 새로운 유형의 바이오여과재로 내충격성과 긴 사용 수명 등의 장점이 있지만 실제 적용 효과는 보고되지 않았습니다. 이를 위해 16S rDNA 고{12}} 처리량 시퀀싱 기술을 사용하여 세 가지 수처리 바이오여과재의 생물막 형성 상황을 분석하는 동시에 큰입배스의 성장 상황을 분석하여 실용적인 수처리용 바이오여과재를 선별하고 큰입배스 산업화 순환 양식에 효율적인 수처리 매체를 제공했습니다.
1. 재료 및 방법
1.1 시험자료
이 테스트를 위해 선택된 바이오필터 매체는 다음과 같습니다.사각 스펀지, 바이오칩, 그리고유동층 공, 에 표시된 것처럼그림 1. 사각 스펀지 재질은 폴리우레탄으로 한 변의 길이가 2.0cm, 비표면적(3.2~3.5)×10⁴m²/m3의 정육면체 모양이다. 바이오칩 소재는 직경 3.0cm, 두께 약 0.11cm, 비표면적 5.5×10³m²/m²의 원형 모양의 폴리에틸렌입니다. 유동층 볼 재질은 폴리에틸렌이며 유효 비표면적은 500~800m²/m3입니다.
1.2 실험적 그룹화
정사각형 스폰지 바이오필터 미디어 처리 그룹은 그룹 T1로 설정되었고 해당 미디어 생물막은 B1로 표시되었으며 해당 양식수는 W1로 표시되었습니다. 바이오칩 바이오필터 배지 처리 그룹을 그룹 T2로 설정하고, 해당 배지 생물막을 B2로 표시하고, 해당 양식수를 W2로 표시했습니다. 유동층 볼 바이오필터 미디어 처리 그룹은 그룹 T3으로 설정되었고 해당 미디어 생물막은 B3으로 표시되었으며 해당 양식수는 W3으로 표시되었습니다.
1.3 양식 시스템
실험은 Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries의 Balidian 종합 실험 기지의 순환 양식 시스템에서 수행되었습니다.배양조는 총 9개, 용량 500L, 유효수량 350L였다. 바이오필터 수조는 길이 80cm, 폭 50cm, 높이 50cm, 용량 200L, 유효수량 120L의 플라스틱 수조로 제작하였다.. 배양조와 바이오필터 탱크는 물 펌프로 연결되어 내부 순환을 형성하고 유속은 3~4L/min, 산소화를 위한 통기, 물의 용존 산소량은 5mg/L 이상으로 유지됩니다. 바이오여과재는 무작위로 그룹화되었으며 각 유형의 바이오여과재에는 3개의 복제물이 있었고 각 바이오여과 탱크에는 2.0kg의 바이오여과재가 적재되었으며 동시에 서방성 탄소원이 정지되었습니다-. 생물막 배양 기간 동안 매일 10%의 물을 갈아주었습니다.초기 수질 지표: 총질소(TN) 9.41mg/L, 총인(TP) 1.02mg/L, 암모니아성질소(TAN) 1.26mg/L, 아질산염질소(NO2⁻-N) 0.04mg/L, 과망간산염 지수(CODₘₙ) 3.73mg/L.
1.4 어류 및 문화 관리 테스트
양식종으로는 큰입배스가 사용되었다. 시험 시작 전 7일 동안 순환수에 적응시켰다.테스트는 2022년 8월 11일부터 2022년 9월 22일까지 42일간 진행되었습니다.. 표면 손상이 없고 건강하고 활발한 큰입 배스를 그룹화하여 각 양식 수조에 60마리씩 사육하고 하루 2회 먹이를 주었으며, 먹이는 시간은 오전 7시, 오후 16시로 하루 먹이는 양은 전체 어체 질량의 약 1.0%~1.5%를 차지했습니다. 시험어의 초기 체중은 (20.46±0.46)g이었다.
1.5 샘플 수집
바이오 필터 탱크의 물 샘플은 2일마다 수집되어 수온, 용존 산소, pH 값과 같은 지표를 기록하고 암모니아 질소 및 아질산염 질소를 측정했습니다. 실험 시작과 종료 시의 먹이량, 어체 질량, 생존율을 기록하였다. 실험 후, 각 배양조의 물 1L를 멸균수 수집백을 이용하여 수집하고, 0.22μm 필터막으로 여과한 후 -80도 냉동고에 보관하여 추후 사용하였다. 0.5g의 바이오필터 미디어 샘플을 각 바이오필터 탱크에서 무균적으로 채취하여 멸균된 증류수에 보관하고 세게 흔들어서 바이오필름 표면에서 미생물을 제거한 다음 0.22μm 필터 멤브레인을 통해 여과하고 나중에 사용하기 위해 -80도 냉동고에 보관했습니다.
1.6 측정 방법
1.6.1 수질 측정
수온, 용존산소, pH 값은 다음을 사용하여 검출되었습니다.HACH Hq40d 휴대용 수질 분석기. 암모니아성 질소 농도는 Nessler 시약 분광 광도법을 사용하여 측정되었습니다. 염산 나프틸에틸렌디아민 분광광도법을 사용하여 아질산염 질소 농도를 검출했습니다.
1.6.2 양식 성능 측정
어류의 증체율, 사료전환율, 생존율에 대한 계산식은 다음과 같다.
l 체중 증가율= (최종 어류 체중 - 초기 어류 체중) / 초기 체질량 × 100%;
l 사료전환율= 사료 소비/체중 증가;
l 생존율= (실험 종료 시 물고기 수 / 실험 시작 시 초기 물고기 수) × 100%.
1.6.3 미생물 높은-처리량 시퀀싱
박테리아 DNA 추출 키트(OMEGA Biotech, USA)를 사용하여 물과 생물막에서 박테리아 DNA를 추출했습니다. 특정 프라이머 338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3') 및 806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')을 사용하여 박테리아 16S rDNA의 V3 및 V4 영역을 증폭했습니다. PCR은 TransGen AP221-02 반응 시스템을 사용했습니다: 5×FastPfu 완충액 4μL, 2.5mmol/L dNTP 2μL, FastPfu Polymerase 0.4μL, 5μmol/L 정방향 및 역방향 프라이머 각각 0.8μL, BSA 0.2μL, DNA 주형 10ng, ddH2O를 20μL까지 보충했습니다. PCR 반응 조건: 95도에서 3분; 30초 동안 95도, 45초 동안 53도, 1분 동안 72도, 28주기; 10분 동안 72도 확장. PCR 증폭은 PCR 반응 기기 9700(Applied Biosystems® GeneAmp®, USA)에서 수행되었습니다. PCR 산물은 Beads를 사용하여 정제한 후 시퀀싱을 실시했습니다. 시퀀싱은 Shanghai Majorbio BioPharm Technology Co., Ltd.에 의뢰되었습니다.
1.6.4 미생물 다양성 분석
시퀀싱을 통해 얻은 원시 데이터를 먼저 스플라이싱한 후 판독 품질 및 스플라이싱 효과에 대한 품질 관리 필터링, 시퀀스 방향 수정을 거쳐 최적화된 데이터를 얻었습니다. 최종 획득된 Clean 데이터를 정규화한 후 OTU(Operational Taxonomic Units) 클러스터링 분석과 분류학적 분석을 97% 유사성으로 수행하였다. 샘플의 히스토그램은 Excel을 사용하여 그려졌고 히트 맵은 Majorbio Cloud Platform을 사용하여 그려졌습니다.
1.7 데이터 분석
차이의 유의성 분석은 SPSS 16.0 통계소프트웨어를 사용하였고, 다중비교는 Duncan의 분산분석법(ANOVA)을 사용하였다.
2. 결과 및 분석
2.1 다양한 바이오여과재의 생물막 형성 시간
에 표시된 바와 같이그림 2,자연적인 생물막 형성 조건에서 생물여과조 물의 암모니아성 질소 함량은 급격한 증가 후 점차 감소하는 경향을 보였다.암모니아 질소 함량사각 스펀지에 해당하는 바이오필터 탱크의 물은 17일째에 8.13 mg/L로 최고치를 기록한 후 점차 감소하였고,41일 만에 최저치 기록, 이후에는 약 0.20 mg/L로 유지되어정사각형 스펀지의 생물막 형성 시간은 약 17일이었습니다.. 바이오칩과 유동층볼에 해당하는 바이오필터 탱크의 물 중 암모니아성 질소 함량의 변화는 기본적으로 동일하여 변동적인 변화를 보였다. 암모니아 질소 피크는 21일에 각각 7.88 mg/L 및 7.57 mg/L로 나타났습니다.바이오칩과 유동층 볼 바이오여과재의 생물막 형성 시간은 약 21일이었습니다.. 암모니아 질소 함량해당 바이오 필터 탱크에서이 두 매체는 각각 43일과 45일로 최저치로 떨어졌다..
2.2 배양조별 물 pH 값의 변화
에서그림 3, 배양수의 초기 pH값은 7.3임을 알 수 있다. 배양시간이 길어질수록 각 배양조 물의 pH 값은 감소하는 경향을 보였다. 12일 후 모든 배양탱크의 pH 값은 6.0 미만으로 배양종의 성장에 불리하였다.따라서 생물막 형성 12일 이후에는 배양조 물의 pH 값 조정에 주의를 기울여야 한다..
2.3 다양한 바이오여과재와 물의 생물막에 대한 미생물 군집 구성 분석
2.3.1 문 수준의 미생물 군집 구성
에 표시된 바와 같이그림 4,문 수준에서 세 가지 바이오여과재의 생물막에 있는 지배적인 박테리아는 동일했으며 모두 Proteobacteria, Actinobacteriota, Bacteroidota 및 Chloroflexi였습니다. 이들의 결합된 상대 풍부도는 각각 68.96%, 64.74%, 65.45%였습니다. 해당 배양수 내 우점세균은 서로 달랐다. W1의 지배적인 박테리아는 Actinobacteriota였으며 상대적 풍부도는 64.66%였습니다. W2와 W3의 지배적인 박테리아는 프로테오박테리아(Proteobacteria)였으며, 상대적 존재비는 각각 34.93%와 50.10%였습니다.
그림. 4 문 수준에서 다양한 생물막과 물에 있는 박테리아의 군집 구성
2.3.2 가족 수준의 미생물 군집 구성
에 표시된 바와 같이그림 5, 세 가지 매체의 생물막에서 박테리아의 약 48%는 상대적 풍부도가 모두 3% 미만인 박테리아 군집이었습니다. B1과 B2의 주요 박테리아는 동일했으며, 둘 다 Xanthomonadaceae였으며, 상대적 풍부도는 각각 11.64%와 9.16%였습니다. B3의 우점 박테리아는 JG30-KF-CM45로, 상대적 풍부도는 10.54%였습니다. 배양수에 우세한 박테리아는 바이오여과재에 있는 박테리아와 달랐습니다. Microbacteriaceae는 W1에서 절대적으로 우세한 박테리아였으며 상대적 풍부도는 62.10%였습니다. W2의 주요 박테리아는 Microbacteriaceae(13.82%) 외에 특정 비율의 Rhizobiales(8.57%)도 포함했습니다. W3의 지배적인 박테리아는 Rhizobiales였으며, 상대적 풍부도는 38.94%였으며, Flavobacteriaceae가 15.89%의 상대적 풍부도로 그 뒤를 이었습니다.
속 수준의 상위 50종을 집계했습니다.. 수치를 처리한 후 샘플 내 다양한 종의 존재비 변화를 색상 블록의 색상 그라데이션을 통해 표시했습니다. 결과는 다음과 같습니다.그림 6. Leifsonia는 W1의 지배적인 박테리아였으며 상대적 풍부도는 56.16%였습니다. W2의 주요 박테리아는 Leifsonia(10.30%)와 Rhizobiales_Incertae_Sedis(8.47%)였습니다. W3의 주요 박테리아는 Rhizobiales_Incertae_Sedis였으며 상대적 풍부도는 38.92%였습니다. 생물막에서 식별 가능한 박테리아 중 Thermomonas는 B1에서 지배적인 속으로, 상대적 풍부도는 4.71%입니다. B2와 B3의 주요 속은 Nitrospira였으며, 상대적 존재비는 각각 4.41%와 2.70%였습니다.
그림. 5 다양한 생물막에서 박테리아의 군집 구성그리고 가족 단위의 물
그림. 6 속 수준에서 다양한 생물막과 물의 박테리아 군집 구성 히트맵
2.4 -다양한 바이오여과재와 물 속의 생물막에 대한 미생물 군집의 다양성 분석
에 표시된 바와 같이표 1, 다양한 배지의 생물막에 대한 미생물 군집의 Shannon 지수는 해당 배양수의 것보다 컸고 Simpson 지수는 반대였습니다. 해당 사육수를 분석한 결과 W2의 세균군집 Shannon 지수가 가장 높아 W1, W3에 비해 유의하게 높았고, Simpson 지수는 W1, W3에 비해 유의하게 낮아 -다양성이 가장 높은 것으로 나타났다. 사육수의 다양성과 달리 - B2 배지의 세균미생물군집 Shannon 지수가 가장 크고 Simpson 지수가 가장 작았으나 3종 바이오여과재 간에는 유의한 차이가 없었다. 모든 샘플의 시퀀싱 범위는 0.990 이상으로 시퀀싱 깊이가 샘플의 실제 수준을 반영할 수 있음을 나타냅니다.
2.5 큰입배스의 성장에 대한 다양한 바이오필터 매체의 영향
표 2다양한 바이오필터 미디어 그룹에서 큰입배스의 성장 상황을 보여줍니다. 배양 44일 후 큰입배스의 최종 체질량 및 증체율은 유동층볼 및 바이오칩 배양군에 비해 사각해면배스군에서 유의하게 높았고, 사료전환율은 다른 군에 비해 현저히 낮았다. 각 그룹의 큰입농어 생존율은 97% 이상으로 그룹 간 유의한 차이는 없었다.
3. 결론 및 고찰
3.1 다양한 바이오여과재의 생물막 형성 시간
생물막은 생물여과재 표면에 부착됩니다. 바이오여과재의 재질, 구조, 비표면적은 바이오필름 형성에 영향을 미치는 주요 요인입니다. 생물막 배양에는 두 가지 일반적인 방법이 있습니다: 자연 생물막 형성 방법과 접종 생물막 형성 방법. 다양한 생물막 형성 방법은 생물막의 성숙 시간에 영향을 미칩니다. Hu Xiaobing et al. 은 생물막 형성을 위해 4가지 방법을 사용하였고, 그 결과 생물막 형성을 위해 키토산, 철이온 첨가, 배출된 슬러지 접종 등의 방법을 사용할 경우 자연 생물막 형성법에 비해 생물막의 성숙시간이 단축되는 것으로 나타났다. 유용미생물이나 활성물질을 첨가하면 생물막 형성시간을 단축할 수 있으나 접종원 확보의 어려움, 공정구축이 복잡하고 비용이 많이 드는 등의 문제점이 있다. Guan Min 등은 유기물 함량이 낮은 조건에서 원수를 직접 바이오필름 형성에 사용하였고, 약 38일 후에 자연 바이오필름 형성을 통해 바이오필터 탱크를 성공적으로 가동하였다. 이번 연구 결과는 본 연구 결과와 유사하다. 본 연구의 결과는 동일한 생물막 형성 조건에서 사각형 스펀지의 생물막 형성 시간이 다른 두 바이오여과재의 생물막 형성 시간보다 짧다는 것을 보여줍니다. 이는 사각 스펀지의 넓은 비표면적, 강한 친수성 및 생물막 부착 용이성과 관련이 있을 수 있습니다. 정사각형 스펀지의 비표면적은 32,000~35,000m²/m²로 다른 두 매체보다 훨씬 큽니다. 또한 사각 스펀지의 재질은 폴리우레탄으로 물에 닿으면 팽창하고 친수성이 높아 물 속에서 미생물의 부착과 성장에 도움이 됩니다. Li Yong 등의 연구 결과. 또한 폴리우레탄 스펀지의 시동 성능과 암모니아성 질소 제거 성능이 폴리프로필렌보다 우수한 것으로 나타났으며 이는 본 연구 결과와 일치합니다. 또한, 본 연구에서 바이오칩 바이오여과재의 비표면적은 5,500m²/m3로 유동층 볼 바이오여과재에 비해 훨씬 크지만, 생물막 형성 시간은 기본적으로 유동층 볼 바이오여과재와 동일하였다. 이는 기공 크기와 관련이 있을 수 있습니다. 일부 연구에서는 바이오여과재의 내부 공간 규모가 생물막의 성장에 영향을 미친다는 점을 지적했습니다. 일부 바이오필터 미디어는 비표면적이 크지만 기공이 미세하고 기공 크기가 성숙한 생물막의 두께보다 훨씬 작아서 기공이 쉽게 막힐 수 있어 기공 내 생물막이 최대 축적에 도달하기 어렵습니다. 바이오칩의 기공은 작아서 바이오필름 성장이 느리고 바이오필름 형성 시간이 길어집니다.
3.2 바이오여과재와 배양수의 미생물 군집 구성
본 연구에서는 바이오여과재와 해당 배양수에 존재하는 우점세균이 서로 달랐다. 바이오여과재의 생물막의 Shannon 지수는 해당 배양수보다 높았으며, 이는 바이오여과재가 미생물을 풍부하게 하는 효과가 있음을 나타냅니다. 이는 Hu Gaoyu 등의 연구 결과와 일치합니다. 담체 유형, 필터 깊이, 염도, 유기물 농도 등과 같이 미생물 군집 구조에 영향을 미치는 많은 요소가 있습니다. 동일한 바이오 필터 매체는 다른 배양 조건에서 생물막에서 다른 미생물 군집을 갖게 됩니다. 저자는 거대 담수새우(Macrobrachium rosenbergii)의 순환 양식 시스템에서 유동층 볼 바이오여과재의 생물막 형성 상황을 연구한 적이 있습니다. 결과는 생물막의 우세한 문은 페르미쿠테스(Firmicutes)인 반면, 본 연구에서는 유동층 공 생물막의 우세한 문은 프로테오박테리아(Proteobacteria)인 것으로 나타났습니다. 이러한 차이가 발생하는 주된 이유는 양식 환경이 다르기 때문일 수 있습니다. 본 연구에 사용된 세 가지 바이오필터 미디어는 바이오필름 배양을 위한 동일한 초기 조건을 가졌습니다. 배지의 물리적 특성이 다르기 때문에 형성되는 생물막의 두께와 내부 환경도 달라서 미생물 군집의 차이가 발생했을 가능성이 있습니다. 따라서 운반체의 차이는 미생물 군집의 차이에 대한 주요 원인입니다. 또한 양식 과정에서 수질 환경과 미생물 군집은 서로 영향을 미칩니다. 미생물 군집의 차이에 대한 이유는 환경 요인과 관련이 있을 수 있습니다. 예를 들어, Yuan Cuilin의 연구에 따르면 신체 내 종속 영양 박테리아의 총 수는 다음과 같습니다. Fan Tingyuet al. pH 값은 물의 총 질소 함량에 큰 영향을 미칠 수 있으며 내륙 강 구역의 수생 세균 군집 분포에 중요한 역할을 한다고 믿었습니다. 암모니아성 질소, 총인 및 엽록소 a도 수역의 박테리아 군집 구성에 다양한 정도로 영향을 미칩니다. 본 연구에서 미생물 군집 구성의 차이를 일으키는 환경 요인은 여전히 추가 확인이 필요합니다.
3.3 큰입배스의 성장에 대한 다양한 바이오필터 매체의 영향
성장 결과를 보면 사각스폰지군의 큰입배스가 가장 빠르게 성장하였으며, 다른 두 배지에 비해 증체율이 현저히 높았고, 사료전환율도 가장 낮았다. 이는 이전 연구 결과와 일치합니다. 본 연구에서는 생물막 형성과 양식업을 동시에 수행하였다. 생물막 형성 시간으로 판단하면 사각형 스폰지 생물막이 더 일찍 성숙되었으며, 생물막이 성숙된 후에는 물 속 암모니아 질소와 아질산염 질소의 농도가 다른 두 매체보다 항상 낮았습니다. 또한, 사각형 스펀지는 일정한 여과 능력을 갖고 있으며, 사육수의 고형 부유 물질 함량이 낮고 물이 비교적 맑습니다. 사각해면군에서 큰입배스가 더 잘 자라는 것은 좋은 수질과 관련이 있을 수 있습니다. 그러나 물 속 총질소, 총인, 과망간산염 지수에 대한 사각형 스폰지 여재의 정화 효과에 대해서는 추가 연구가 필요합니다. 실험 동안 pH 값이 전반적으로 감소하는 경향을 보였다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 배양 12일 후, 모든 배양조의 pH 값은 6.0 미만으로 이는 Zhang Long 등의 연구 결과와 일치합니다. pH 값이 감소하는 것은 생물막을 배양하는 과정에서 수소이온이 많이 생성되어 물의 pH 값이 감소하기 때문입니다. 따라서 생물막 형성 과정에서 배양조 물의 pH 값을 신속하게 조정하여 배양종의 정상적인 성장 범위 내에 있도록 해야 합니다. 경제적 비용을 고려하면 사각 스펀지의 시장 가격은 70~100위안/kg이고 가격은 다른 두 바이오여과재의 중간 정도이다. 성장 결과와 함께 단기적으로 사각 스펀지는 양식 재순환을 위한 비교적 실용적인 수처리 바이오여과재입니다. 그러나 사각 스펀지는 인성이 낮고 수명이 짧습니다. 장기간-사용 효과와 양식 효과에 대해서는 추가 검증이 필요합니다.
요약하자면,자연 생물막 형성 조건에서 정사각형 해면 바이오여과재는 생물막 형성 시간이 가장 짧고 가격도 적당하며, 정사각형 해면군에서 큰입배스의 최종 체질량 및 체중 증가율은 다른 두 바이오여과재에 비해 상당히 높았습니다. 단기적으로는 양식 재순환을 위한 비교적 실용적인 수처리 바이오여과재입니다.